科学问题：本文通过单细胞RNA测序分析，研究膝关节纤维化的细胞异质性和细胞间相互作用机制，揭示CCN2在成纤维细胞与巨噬细胞相互作用中的作用及其通过TGF-β通路介导的纤维化过程，为膝关节纤维化提供潜在的生物标志物和治疗靶点。

实验材料：3名膝关节纤维化组(AF组) 和3名无纤维化组(NC组)

膝关节纤维化（Knee Arthrofibrosis）是一种以关节活动受限为特征的疾病，常在膝关节手术或损伤后发生，给患者带来极大的痛苦和沉重的经济负担。尽管目前已有多种治疗方法，但治疗效果仍不尽如人意，其发病机制也尚未完全明确。近期，一项基于单细胞RNA测序分析的研究揭示了CCN2在膝关节纤维化中的关键作用，为这一疾病的诊断和治疗提供了新的方向。研究人员通过对膝关节纤维化患者和对照组患者的滑膜组织进行单细胞转录组学分析，发现纤维化组中巨噬细胞和成纤维细胞数量显著增加，而类风湿性滑膜细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和T细胞数量减少。进一步研究发现，成纤维细胞与巨噬细胞之间存在相互作用，并通过TGF-β通路诱导成纤维细胞中CCN2的表达，进而导致纤维化。CCN2不仅在成纤维细胞的促纤维化功能（激活、增殖和迁移）中发挥关键作用，还与胶原蛋白体积、TGF-β表达水平呈正相关，与患者的临床预后指标呈负相关。这一发现表明CCN2可能是膝关节纤维化潜在的生物标志物，为未来的诊断和治疗提供了新的靶点。

单细胞转录组测序、伯优^®单细胞测序组织保存液

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1.通过流式细胞术和单细胞RNA测序分析构建的人类滑膜组织的单细胞图谱

为了阐明膝关节纤维化（AF）的潜在机制，我们对膝关节纤维化患者（AF组）和阴性对照组（NC组）的滑膜组织进行了流式细胞术（FCM）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图1a），共六名患者。经过质量控制后，我们共获得68,144个细胞，这些细胞可以被聚类为六个不同的细胞群，分别被注释为：成纤维细胞（THY1、LUM）、巨噬细胞（CD14、MS4A4A）、类风湿性滑膜细胞（FLS）、内皮细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）和T细胞（图1d、e），所有这些细胞类型在六名患者中均有发现（图1f）。我们观察到AF样本中巨噬细胞和成纤维细胞的数量较NC样本显著增加（P<0.001）（图1g），这与流式细胞术的结果一致。成纤维细胞、巨噬细胞、FLS、内皮细胞和VSMC的细胞亚群进一步展示在图1h中。总体而言，流式细胞术（FCM）和单细胞转录组分析均表明，膝关节纤维化（AF）与巨噬细胞和成纤维细胞的富集之间存在密切关联。

2.人类滑膜成纤维细胞的不同纤维化特征

位于膝关节滑膜下层的成纤维细胞在AF中起关键作用。正常情况下，这些细胞通过产生细胞外基质（ECM）维持组织结构和稳态，但在纤维化疾病中，它们过度产生ECM并诱导细胞因子分泌，从而促进纤维化。通过单细胞转录组分析，作者鉴定出三种成纤维细胞亚群：DPP4⁺成纤维细胞（Fib1）、TNC⁺成纤维细胞（Fib2）和APOD⁺成纤维细胞（Fib3）（图2a、b）。与对照组（NC）相比，AF组中Fib1的比例显著增加，而Fib3的比例则有所下降（P<0.01）（图2c）。这表明Fib1可能在AF的发生中发挥重要作用。作者发现，Fib1和Fib2亚群因高表达胶原蛋白COL1A1和COL1A2，被认为是促纤维化的肌成纤维细胞，而Fib3亚群则表现为静止状态，与纤维化关系不大。GO分析显示，促纤维化通路在Fib1和Fib2中显著富集，而Fib3则富集于抗纤维化通路。此外，Fib1以DPP4高表达为特征，Fib2高表达TNC和CDH11，这些基因均与纤维化密切相关；Fib3则以APOD、C3和CXCL14高表达为特征，与纤维化相关性较低。这些发现为理解膝关节纤维化的细胞机制提供了重要依据。为了研究这三种亚群之间的分化路径，作者进行了RNA速率分析。结果显示，成纤维细胞的分化主要由Fib1驱动，存在从Fib1到Fib2和从Fib1到Fib3的两条分化路径（图2g）。这与DPP4⁺成纤维细胞作为祖细胞的先前研究结果一致。

3. 滑膜巨噬细胞及其他滑膜细胞的鉴定与分子特征分析

巨噬细胞是促纤维化因子（如TGF-β、IL-1β和PDGF）的重要来源，在膝关节纤维化（AF）中具有重要作用，并表现出高度的可塑性和异质性。单细胞转录组分析鉴定出三种巨噬细胞亚群：Macro1（TREM2⁺）、Macro2（TTN⁺）和Macro3（EGFR⁺）（图3a、b）。与对照组（NC）相比，AF组中Macro1的比例显著增加（P<0.001），而Macro2的比例显著减少（P<0.001），Macro3的比例在两组中无显著差异（P=0.247）（图3c）。

研究发现，Macro1和Macro2高表达M1型标记物，参与固有免疫反应，如补体激活和白细胞激活（图3f）；而Macro3高表达M2型标记物和促纤维化基因（如EGFR和PDGFRα），与细胞通讯密切相关（图3f）。这表明Macro3可能通过与成纤维细胞的相互作用，在纤维化过程中发挥重要作用。通过RNA速率分析，作者发现巨噬细胞亚群Macro1倾向于分化为Macro2，而Macro3相对稳定，形成一个与Macro1和Macro2不同的独特细胞簇（图3g）。Macro3可能参与纤维化过程。这表明滑膜组织中的巨噬细胞具有高度异质性，且Macro3可能在纤维化中发挥作用。

4.基于成纤维细胞与巨噬细胞相互作用的CCN2鉴定为膝关节纤维化（AF）的潜在生物标志物

作者通过CellChat分析细胞间相互作用，发现AF和NC组中内皮细胞、血管平滑肌细胞以及免疫细胞与非免疫细胞之间存在较高相互作用概率。与NC组相比，AF组中成纤维细胞与巨噬细胞的相互作用显著增强（图4a）。结合成纤维细胞和巨噬细胞在滑膜组织中比例增加以及纤维化相关性，研究聚焦于成纤维细胞与巨噬细胞的相互作用（图4b）。分析发现，成纤维细胞与巨噬细胞的相互作用在多种促纤维化通路（如非典型Wnt、TGF-β、tenascin、FGF和CXCL通路）中上调，且成纤维细胞和巨噬细胞在这些通路中分别扮演接收者和发送者的角色，这些途径都是促纤维化的（图 4c ）。这一结果与 Fib1 和 Fib2 主要参与纤维化过程，而 Macro3 更多地参与细胞间通讯的观察结果一致。

为了进一步研究分子机制和潜在的生物标志物，作者专注于成纤维细胞中与通路相关的基因变化，鉴定了21个相关基因（图4d），并基于统计差异进一步筛选出19个潜在的生物标志物基因（PBGs）。GO分析显示PBGs在促纤维化通路中高度富集（图4e）。通过分析成纤维细胞中AF组与NC组间前50个差异表达基因（DEGs）的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，研究人员发现CCN2基因同时是PBGs和中心枢纽蛋白之一（图4f）。进一步比较两组细胞中PBGs的表达水平，发现CCN2在AF组中的表达显著高于NC组，且位于成纤维细胞DEGs的前五位。因此，CCN2被认为是AF的潜在生物标志物。

在深入探索AF的分子机制和寻找潜在生物标志物的过程中，作者的研究团队通过单细胞转录组图谱揭示了成纤维细胞与巨噬细胞之间的相互作用，以及TGF-β通路中CCN2在AF中的关键作用。这些发现不仅增进了我们对AF病理过程的理解，而且为CCN2作为新型生物标志物的可能性提供了有力证据。

参考文献：

Li Z, Jiang J, Cai K, Qiao Y, Zhang X, Wang L, Kang Y, Wu X, Zhao B, Wang X, Zhang T, Lin Z, Wu J, Lu S, Gao H, Jin H, Xu C, Huangfu X, James Z, Chen Q, Zheng X, Liu NN, Zhao J. CCN2 mediates fibroblast-macrophage interaction in knee arthrofibrosis based on single-cell RNA-seq analysis. Bone Res. 2025 Feb 24;13(1):26. doi: 10.1038/s41413-025-00400-9. PMID: 39994205; PMCID: PMC11850813.